A análise de pureza de peptídeo normalmente é realizada usando cromatografia líquida de alto-desempenho (HPLC). O objetivo principal da análise por espectrometria de massa é confirmar o peso molecular; atualmente, as principais técnicas empregadas para análise de peptídeos são a espectrometria de massa por ionização por eletrospray (ESI-MS) e a espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-MS).
A análise da composição de aminoácidos revela os tipos e quantidades de aminoácidos presentes em um peptídeo, enquanto o princípio fundamental subjacente à análise da sequência de aminoácidos é a degradação de Edman.
Os métodos para identificar estruturas secundárias peptídicas incluem Dicroísmo Circular (CD), Ressonância Magnética Nuclear (RMN), difração de raios X-, entre outros.
Durante o processo de síntese-de fase sólida, diversas impurezas-como sequências de exclusão, sequências de inserção, peptídeos-mal acoplados, peptídeos epimerizados e peptídeos oxidados-podem ser gerados. A identificação de tais impurezas relacionadas-com peptídeos é normalmente realizada usando Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massa em Tandem (LC/MS/MS); LC-MS permite a determinação precisa da massa de um peptídeo, enquanto MS/MS é utilizado para elucidar sua sequência. Além disso, técnicas cromatográficas de HPLC podem ser empregadas para obter separação e detecção eficazes.
Na síntese-de peptídeos em fase sólida, a eficiência do acoplamento é avaliada principalmente pela detecção da presença de grupos amino livres na resina; este método de detecção é conhecido como teste de Kaiser (ou teste de ninidrina). Se grupos amino livres estiverem presentes, desenvolve-se uma cor azul ou marrom-avermelhada.